Validación de un método analítico para cuantificación de ferritina en líquido cefalorraquídeo / Validation of an analytical method for the quantification of ferritin in cerebrospinal fluid

Resumen La ferritina es una proteína de gran tamaño que se encuentra fisiológicamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) en concentraciones de 2-10 ng/mL. Su elevación puede utilizarse como biomarcador en distintas condiciones patológicas. El procedimiento de validación tradicional para la medición en LCR no puede ser utilizado debido a la ausencia de controles y calibradores comerciales para esta matriz. El objetivo de este trabajo fue llevar a cabo una validación analítica de ferritina en LCR. Se realizaron ensayos de estimación de precisión y veracidad mediante el protocolo EP15-A3, linealidad por el protocolo EP6-A (ambos de la guía de la CLSI), recuperación, estabilidad, contaminación por arrastre, interferencia por hemólisis y bilirrubina y límite de detección (LoD). La ferritina en LCR en el autoanalizador DxI 800 de Beckman Coulter tuvo una performance intra e interensayo <3,7%, el ensayo denota linealidad en el intervalo de 2,1-547 ng/mL; se estableció estabilidad por un período de 5 días y la recuperación resultó ser aceptable. No se evidenció efecto de contaminación por arrastre ni interferencia por hemólisis hasta un rango entre 300-500 mg/dL de hemoglobina, ni interferencia por bilirrubina hasta una concentración de 16,0 mg/dL de bilirrubina total. El LoD fue de 0,4 ng/mL. Por medio de los ensayos realizados se logró validar la ferritina en LCR a partir de la utilización de pools de muestras, lo que pudo garantizar la confiabilidad y exactitud del método analítico.

Abstract Ferritin is a large protein physiologically present in the cerebrospinal fluid (CSF) in concentrations of 2-10 ng/mL. Its elevation can be used as a biomarker in several pathological conditions. The traditional validation procedure for measurement in CSF cannot be used due to the absence of commercial controls and calibrators for this matrix. The objective of the present study was to perform CSF ferritin analytical validation. Assays such as precision and accuracy estimation through the EP15-A3 protocol, linearity according to the EP6-A protocol (both from the CLSI guidelines), recovery, stability, carry-over, hemolysis and bilirubin interference and limit of detection (LoD) were conducted. Serum samples with different concentrations of ferritin were added to aliquots of a normal CSF pool. CSF ferritin in the Beckman Coulter DxI 800 had a <3.7% intra and inter-assay performance, the assay shows linearity in the 2.1 -547 ng/mL interval, stability was established for a 5-day period and the recovery was acceptable. There was neither carry-over effect or hemolysis interference up to a range of 300-500 mg/dL of hemoglobin, nor interference by bilirubin up to 16.0 mg/dL of total bilirubin. The LoD was 0.4 ng/mL. By means of the performed assays, CSF ferritin was validated by using sample pools, thereby ensuring the reliability and accuracy of the analytical method.

Resumo A ferritina é uma grande proteína fisiologicamente encontrada no líquido cefalorraquidiano (LCR) em concentrações de 2 a 10 ng/mL. Sua elevação pode ser usada como biomarcador em diferentes condições patológicas. O procedimento de validação tradicional para medição no LCR não pode ser usado devido à ausência de controles e calibradores comerciais para esta matriz. O objetivo deste estudo foi realizar uma validação analítica da ferritina no LCR. Foram realizados estudos de precisão e veracidade utilizando o protocolo EP15-A3, linearidade pelo protocolo EP6-A (ambos das diretrizes do CLSI), recuperação, estabilidade, contaminação transportada, interferência de hemólise e bilirrubina e limite de detecção (LoD). A ferritina no LCR no DxI 800 da Beckman Coulter teve um desempenho intra e inter-ensaio <3,7%, o ensaio denota linearidade na faixa de 2,1-547 ng/mL, a estabilidade foi estabelecida em um período de 5 dias e a recuperação foi considerado aceitável. Nenhum efeito de transporte ou interferência por hemólise foi evidenciado até um intervalo entre 300-500 mg/dL de hemoglobina, nem interferência pela bilirrubina até uma concentração de 16,0 mg/dL de bilirrubina total. O LoD foi de 0,4 ng/mL. Através dos testes realizados, a ferritina no LCR foi validada, com base no uso de pool de amostras, o que poderia garantir a confiabilidade e a acurácia do método analítico.

Bisfenol-A: cuantificacion en orina de mujeres embarazadas por cromatografia gaseosa-espectrometria de masa / Bisfenol-A: quantification in urine of pregnant women by gas chromatography-mass spectrometry / Bisfenol-A: quantificacao em urina de gestantes por cromatografia gasosa-espectrometria de massa

El uso de bisfenol-A (BPA) a nivel de la industria global se ha venido incrementando en los ultimos anos, y fueron los mercados emergentes los impulsores de esta demanda creciente. Las aplicaciones de BPA en la industria de los alimentos y bebidas representan solo del 3 al 4% del consumo global de policarbonato, pero su uso esta siendo reexaminado debido a que se conocieron varios trabajos cientificos que indican la existencia de una relacion directa entre el BPA y los efectos adversos para la salud. La contaminacion de los alimentos y bebidas se produce por migracion del BPA desde los envases que los contienen (alimentos enlatados, vinos, etc.), y es la principal fuente de exposicion en el humano. Para evaluar dicha exposicion se desarrollo y valido un metodo analitico por cromatografia gaseosa acoplada a espectrometria de masa para la cuantificacion de BPA total en orina de mujeres embarazadas atendidas en el Hospital Italiano de Buenos Aires en el ano 2013, con un limite de cuantificacion de 2,0 ng/mL y un limite de deteccion de 0,8 ng/mL. De las 149 muestras de orina analizadas, el 66,4% fueron cuantificables, con la mediana de BPA total de 4,8 ng/mL (4,3 ng/mg de creatinina) y la media geometrica de 4,8 ng/mL (4,7 ng/mg de creatinina).

The use of bisphenol-A (BPA) at the level of the global industry has been increasing in recent years, with emerging markets being the drivers of this growing demand. BPA applications in the food and beverage industry represent only 3 to 4% of the global consumption of polycarbonate, but its use is being reexamined because several scientific works were reported indicating the existence of a direct relationship between BPA and adverse effects on health. The contamination of food and beverages is produced by the migration of BPA from the containers that hold them (canned foods, wines, etc.) and it is the main source of exposure in humans. To evaluate this exposure, an analytical method was developed by gas chromatography coupled to mass spectrometry for the quantification of total BPA in urine of pregnant women treated at the Hospital Italiano de Buenos Aires in 2013, with a limit of quantification of 2.0 ng/mL and of detection of 0.8 ng/mL. Of the 149 urine samples analyzed, 66.4% were quantifiable, with a median total BPA of 4.8 ng/mL (4.3 ng/mg creatinine) and a geometric mean of 4.8 ng/mL (4.7 ng/mg creatinine).

O uso de bisfenol-A (BPA) ao nivel da industria global foi aumentando nos ultimos anos, e foram os mercados emergentes que deram impulso a essa demanda crescente. As aplicacoes de BPA na industria de alimentos e bebidas representam apenas 3 a 4% do consumo global de policarbonato, mas seu uso esta sendo reexaminado visto que varios trabalhos cientificos indicando a existencia de uma relacao direta entre o BPA e os efeitos adversos na saude foram conhecidos. A contaminacao dos alimentos e bebidas e produzida pela migracao de BPA das embalagens que os contem (alimentos enlatados, vinhos, etc.) e e a principal fonte de exposicao em humanos. Para avaliar esta exposicao, foi desenvolvido e avaliado um metodo analitico por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas para a quantificacao do BPA total na urina de gestantes atendidas no Hospital Italiano de Buenos Aires em 2013, com um limite de quantificacao de 2,0 ng/mL e um limite de deteccao de 0,8 ng/mL. Das 149 amostras de urina analisadas, 66,4% foram quantificaveis, com uma mediana de BPA total de 4,8 ng/mL (4,3 ng/mg de creatinina) e a media geometrica de 4,8 ng/mL (4,7 ng/mg de creatinina).

Investigación traslacional en microbioma (InTraMic): un área de interés común y creciente en el IMTIB, Hospital Italiano e Instituto Universitario / Translational research in microbiome (InTraMic): an area of common and growing interest at IMTIB, Hospital Italiano and Instituto Universitario

Se estima que aproximadamente 100 trillones de microorganismos (incluidos bacterias, virus y hongos) residen en el intestino humano adulto y que el total del material genético del microbioma es 100 veces superior al del genoma humano. Esta comunidad, conocida como microbioma se adquiere al momento del nacimiento a través de la flora comensal de la piel, vagina y heces de la madre y se mantiene relativamente estable a partir de los dos años desempeñando un papel crítico tanto en el estado de salud como en la enfermedad. El desarrollo de nuevas tecnologías, como los secuenciadores de próxima generación (NGS), permiten actualmente realizar un estudio mucho más preciso de ella que en décadas pasadas cuando se limitaba a su cultivo. Si bien esto ha llevado a un crecimiento exponencial en las publicaciones, los datos sobre las poblaciones Latinoamérica son casi inexistentes. La investigación traslacional en microbioma (InTraMic) es una de las líneas que se desarrollan en el Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica (IMTIB). Esta se inició en 2018 con la línea de cáncer colorrectal (CCR) en una colaboración con el Colorectal Cancer Research Group del Leeds Institute of Medical Research en el proyecto Large bowel microbiome disease network: Creation of a proof of principle exemplar in colorectal cancer across three continents. A fines de 2019 se cumplió el objetivo de comprobar la factibilidad de la recolección, envío y análisis de muestras de MBF en 5 continentes, incluyendo muestras provenientes de la Argentina, Chile, India y Vietnam. Luego de haber participado de capacitaciones en Inglaterra, se ha cumplido con el objetivo de la etapa piloto, logrando efectivizar la recolección, envío y análisis metagenómico a partir de la secuenciación de la región V4 del ARNr 16S. En 2019, la línea de enfermedad de hígado graso no alcohólico se sumó a la InTraMic iniciando una caracterización piloto en el marco de una colaboración con el laboratorio Novartis. Los resultados de ese estudio, así como el de cáncer colorrectal, están siendo enviados a publicación. En 2020, con la incorporación de la línea de trasplante alogénico de células progenitoras hematopoyéticas, fue presentado un proyecto para un subsidio del CONICET que ha superado la primera etapa de evaluación. En el presente artículo se brinda una actualización sobre la caracterización taxonómica de microbioma y se describen las líneas de investigación en curso. (AU)

It is estimated that approximately 100 trillion microorganisms (including bacteria, viruses, and fungi) reside in the adult human intestine, and that the total genetic material of the microbiome is 100 times greater than that of the human genome. This community, known as the microbiome, is acquired at birth through the commensal flora of the mother's skin, vagina, and feces and remains relatively stable after two years, playing a critical role in both the state of health and in disease. The development of new technologies, such as next-generation sequencers (NGS), currently allow for a much more precise study of it than in past decades when it was limited to cultivation. Although this has led to exponential growth in publications, data on Latin American populations is almost non-existent. Translational research in microbiome (InTraMic) is one of the lines developed at the Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica (IMTIB). This started in 2018 with the Colorectal Cancer Line (CRC) in a collaboration with the Colorectal Cancer Research Group of the Leeds Institute of Medical Research in the project "Large bowel microbiome disease network: Creation of a proof of principle exemplar in colorectal cancer across three continents". At the end of 2019, the objective of verifying the feasibility of collecting, sending and analyzing MBF samples on 5 continents, including samples from Argentina, Chile, India and Vietnam, was met. After having participated in training in England, the objective of the pilot stage has been met, achieving the collection, delivery and metagenomic analysis from the sequencing of the V4 region of the 16S rRNA. In 2019, the non-alcoholic fatty liver disease line joined InTraMic, initiating a pilot characterization in the framework of a collaboration with the Novartis laboratory. The results of that study, as well as that of colorectal cancer, are being published. In 2020, with the incorporation of the allogeneic hematopoietic stem cell transplantation line, a project was presented for a grant from the CONICET that has passed the first stage of evaluation. This article provides an update on the taxonomic characterization of the microbiome and describes the lines of ongoing research. (AU)

Cuantificación de Bisfenol-A libre en sangre de cordón umbilical humano a nivel de trazas / Quantification of free Bisphenol-A in human umbilical cord blood at trace level / Quantificação de Bisfenol-A livre em sangue de cordão umbilical humano a nível de traços

El Bisfenol-A (BPA) es ampliamente utilizado en la producción de plásticos de policarbonato, por lo que está presente en productos de uso masivo. Es un disruptor endócrino e incide en el desarrollo gonadal y del sistema nervioso central. La exposición de mujeres embarazadas al BPA es particularmente preocupante para el feto en desarrollo, debido a que atraviesa la placenta pasando a la sangre de cordón y al líquido amniótico. Esto se suma a la escasa o nula actividad enzimática fetal para biotransformarlo en BPA-glucurónido inactivo, causando posibles efectos nocivos a la descendencia a dosis muy bajas y sostenidas. Con el propósito de estudiar la exposición al BPA y sus efectos en la población de Argentina se desarrolló y validó un método analítico por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa, que permite la cuantificación de trazas de BPA libre (forma estrogénica, activa) en plasma de cordón umbilical. La técnica consiste en la precipitación de proteínas de la sangre de cordón por agregado de acetonitrilo y posterior centrifugado e inyección del sobrenadante. Se utilizó una elución isocrática en la cromatografía líquida, y la espectrometría de masa se realizó empleando Electrospray negativo en modo de monitoreo de reacciones múltiples. Los valores de BPA libre cuantificados están en el rango de 1,0 a 12,1 ng/mL, límite de detección: 0,6 ng/mL.

Bisphenol-A (BPA) is widely used in the production of polycarbonate plastics and therefore, it is present in products of massive use. It is known as an endocrine disruptor and has an impact on gonadal and central nervous system development. Exposure of pregnant women to BPA is particularly worrying for the developing fetus because it crosses the placenta into the cord blood and amniotic fluid, coupled with little or no fetal enzymatic activity to biotransform it into inactive BPA-glucuronide, causing possible harmful effects to the offspring at very low and sustained doses. With the aim to study the exposure to BPA and its effects on the population of Argentina, an analytical method was developed and validated by liquid chromatography coupled to mass spectrometry, which allows the quantification of trace amounts of free BPA (estrogenic, active form) in plasma of umbilical cord. The method involves protein precipitation by the addition of acetonitrile and subsequent centrifugation and injection of supernatant. An isocratic elution was used in liquid chromatography, and mass spectrometry was performed using negative Electrospray mode in multiple reaction monitoring. Quantified free BPA values are in the range of 1.0 to 12.1 ng/mL, Detection Limit: 0,6 ng/mL.

O Bisfenol-A (BPA) é amplamente utilizado na produção de plásticos de policarbonato, portanto está presente em produtos de uso massiço. Ele é um disruptor endócrino e tem um impacto no desenvolvimento gonadal e do sistema nervoso central. A exposição de mulheres grávidas ao BPA é particularmente preocupante para o feto em desenvolvimento, visto que atravessa a placenta passando ao sangue do cordão e ao líquido amniótico Isso é adicionado à pouca ou nula atividade enzimática fetal para biotransformá-lo em BPA-glicuronídeo inativo, o que causa possíveis efeitos nocivos aos descendentes em doses muito baixas e sustentadas. Visando a estudar a exposição ao BPA e seus efeitos na população da Argentina, foi desenvolvido e validado um método analítico por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa, que permitem a quantificação de vestígios de BPA livre (forma estrogênica, livre) em plasma do cordão umbilical. A técnica consiste na precipitação de proteínas do sangue de cordão por adição de acetonitrila e posterior centrifugação e injeção no sobrenadante. Na cromatografia líquida, foi utilizada uma eluição isocrática, e a espectrometria de massa foi realizada utilizando Electrospray negativo em modo de monitoramento de reações múltiplas. Os valores de BPA livre quantificados estão na faixa de 1,0 a 12,1 ng/mL, limite de detecção: 0,6 ng/mL.

Validación de una técnica de actividad de factor von Willebrand que utiliza glicoproteína Ib mutada / Validation of a method based on a mutant glycoprotein Ib for von Willebrand factor activity measure / Validação de uma técnica da atividade do fator de von Willebrand que usa mutante de glicoproteína Ib

La medida de actividad del factor von Willebrand (vWF) es importante para el diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand (vWD). El equipo Innovance®vWF Ac (Siemens Healthcare Diagnostics) utiliza un método inmunoturbidimétrico diseñado para coagulómetros Sysmex CA (Siemens). El objetivo del estudio fue desarrollar y validar la metodología del reactivo Innovance®vWF Ac para el coagulómetro ACL TOP 700 (Instrumentation Laboratory, IL) y realizar un estudio comparativo de su desempeño frente a la de la técnica vWF Activity (vWF Act, IL) y a la del cofactor de ristocetina (vWF:RCo) por agregación de transmisión de luz. Se desarrolló, calibró y validó la técnica mediante estudios de verificación de linealidad y precisión total para dos niveles de control. Se midió la actividad del vWF por los métodos Innovance®vWF Ac y vWF Act en 82 muestras consecutivas dentro del rango reportable. Para comparar métodos se utilizó la regresión de Deming. El análisis inicial de los resultados de Innovance®vWF Ac y vWF Act demostró que no eran estadísticamente comparables. Se observó un Bias negativo para Innovance®vWF Ac en muestras con vWF Act>150%. Excluyendo las mismas, se demostró que los resultados de ambas pruebas eran comparables, al igual que los de Innovance®vWF Ac y vWF:RCo en un subgrupo de 27 muestras. La adaptación del método Innovance®vWF Ac en el ACL TOP 700 fue exitosa, presentó linealidad y precisión acorde con los requerimientos de calidad del laboratorio, brindando resultados comparables a los de vWF Act y vWF:RCo en el rango de 5-150%, útil para el diagnóstico de vWD.

Measurement of vonWillebrand factor (vWF) activity is important for the diagnosis of von Willebrand disease (vWD). Innovance®vWF Ac assay was designed to Sysmex CA (Siemens) coagulometer. The aim of the study was to develop and validate a method for Innovance®vWF Ac in the ACL TOP 700 (Instrumentation Laboratory) coagulometer and to compare its performance against vWF Activity assay (Instrumentation Laboratory, vWF Act) and Ristocetin cofactor assay by light transmission aggregation (vWF:RCo). The method was designed, calibrated and validated through verification of linearity and total precision studies at two levels of control plasmas. vWF activity was measured by Innovance®vWF Ac and vWF Act in 82 consecutive samples with vWF Act values within the reportable range. For method comparison, Deming regression was used. The initial analysis of results showed that they were not statistically comparable with a negative Bias with Innovance®vWF Ac in samples with vWF Act>150%. Excluding these samples, Deming regression curve showed that both tests gave statistically comparable results, and also did Innovance®vWF Ac and vWF:RCo in a subset of 27 samples. The adaptation of the Innovance®vWF Ac method on the ACL TOP 700 coagulometer was successful, it met the quality requirements of the laboratory for linearity and accuracy, providing comparable results to vWF Act and vWF:RCo in the of 5-150% range, useful for vWD diagnosis.

Medir a atividade do fator von Willebrand (vWF) é importante para o diagnóstico da doença de von Willebrand (vWD). A equipe Innovance®vWF Ac (Siemens Healthcare Diagnostics) utiliza um método imunoturbidimétrico projetado para coagulômetros Sysmex CA (Siemens). O objetivo do estudo foi desenvolver e validar a metodologia do reagente Innovance®vWF Ac para o coagulômetro ACL TOP 700 (laboratório de instrumentação, IL) e realizar um estudo comparativo do seu desempenho perante a técnica vWF Activity (vWF Act, IL) e a do cofator de ristocetina (vWF:RCo) por agregação de transmissão de luz. A técnica foi projetada, calibrada e validada através de testes de verificação da linearidade e total precisão para dois níveis de controle. Foi mensurada a atividade do vWF pelos métodos Innovance®vWF Ac e vWF Act em 82 amostras consecutivas dentro do intervalo reportável. Para comparar métodos foi utilizada a regressão de Deming. A análise inicial dos resultados da Innovance®vWF Ac e vWF Act demonstrou que eles não eram estatisticamente comparáveis. Observou-se um viés negativo para Innovance®vWF Ac em amostras com vWF Act> 150%. Excluindo as mesmas, foi demonstrado que os resultados de ambos os testes eram comparáveis, do mesmo modo que os Innovance®vWF Ac e vWF:RCo num subgrupo de 27 amostras. A adaptação do método Innovance®vWF Ac no ACL TOP 700 foi bem-sucedida, apresentou linearidade e precisão conforme os requisitos de qualidade do laboratório, fornecendo resultados comparáveis aos vWF Act e vWF:RCo na faixa de 5-150%, útil para o diagnóstico da vWD.